1 引言：強酸性化合物分析的專用工具

在復(fù)雜基質(zhì)中提取強酸性化合物，是分析化學(xué)領(lǐng)域的一項經(jīng)典難題。這類目標(biāo)物——如磺酸類藥物、全氟化合物（PFOA/PFOS）、合成著色劑等——往往因離子化程度高、極性大，在常規(guī)反相吸附劑上保留微弱，難以實現(xiàn)有效富集。MAX柱服務(wù)于弱酸性化合物，而WAX（Weak Anion Exchange，弱陰離子交換）固相萃取柱則開辟了另一條技術(shù)路徑：通過引入弱堿性三級胺基功能團，在保持對強酸性化合物有效保留的同時，實現(xiàn)選擇性凈化與溫和洗脫。這一特性使WAX柱在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、生物分析等領(lǐng)域扮演著日益重要的角色。

2 WAX固相萃取柱的物理化學(xué)基礎(chǔ)

2.1 填料結(jié)構(gòu)與雙重保留機制

WAX固相萃取柱的核心在于其三級胺基功能團的設(shè)計。它以高度交聯(lián)的聚苯乙烯/二乙烯苯（PS/DVB）為聚合物基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合引入三級胺基（-NR?）官能團，形成具有反相和弱陰離子交換雙重特性的吸附材料。這種設(shè)計使WAX柱能夠通過兩種機制協(xié)同捕獲目標(biāo)物：反相作用保留非極性或弱極性化合物，而弱陰離子交換作用則選擇性保留帶負(fù)電荷的強酸性化合物。

表：WAX固相萃取柱典型填料參數(shù)

部分廠商采用HLB（親水親脂平衡）基質(zhì)鍵合哌嗪基團的方式制備WAX柱，繼承了HLB吸附劑的“水可浸潤"特性，即使在柱床干涸的情況下也能保持對水溶液的潤濕性和保留能力。

2.2 保留與洗脫的pH調(diào)控原理

WAX柱的獨特之處在于其三級胺基功能團的可離子化特性。功能團的離子化狀態(tài)隨pH變化而改變：

·         在酸性條件下（pH < pKa）：三級胺基質(zhì)子化為帶正電的銨離子（-NR?H?），可保留帶負(fù)電的強酸性目標(biāo)物（陰離子交換）

·         在堿性條件下（pH > pKa）：三級胺基去質(zhì)子化為中性，離子交換作用消失，目標(biāo)物被釋放

這一pH響應(yīng)特性為方法開發(fā)提供了靈活的調(diào)控手段。WAX柱特別適用于pKa < 1的強酸性化合物，包括含有磺酸基（-SO?H）、磷酸基（-PO?H?）等強酸性基團的化合物。對于這類化合物，如果使用強陰離子交換柱（MAX），其強烈的離子相互作用可能導(dǎo)致洗脫困難；而WAX柱的弱陰離子交換作用強度適中，洗脫更加溫和可控。

2.3 目標(biāo)物選擇性：哪些化合物適合WAX柱？

WAX柱的設(shè)計目標(biāo)非常明確——強酸性化合物。具體而言，以下幾類是WAX柱的典型應(yīng)用對象：

磺酸類化合物：如人工合成著色劑中的檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)等，這些分子中的磺酸基團使它們在酸性條件下帶負(fù)電，與WAX柱的質(zhì)子化胺基發(fā)生離子交換作用。

全氟烷基物質(zhì)（PFAS）：包括全氟辛酸（PFOA）和全氟辛磺酸（PFOS）等環(huán)境持久性有機污染物。這類化合物既含有疏水的碳氟鏈，又含有親水的強酸性頭基，WAX柱的雙重保留機制對其特別有效。

強酸性藥物及代謝物：如某些非甾體抗炎藥、利尿劑等pKa < 3的藥物，可從生物體液中通過WAX柱有效萃取。

3 標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與條件優(yōu)化

3.1 經(jīng)典六步法操作程序

WAX固相萃取柱的操作流程遵循六步法，其中pH條件的選擇是方法成功的關(guān)鍵。

活化：依次加入甲醇和水（各3-6 mL，依柱規(guī)格而定）。甲醇潤濕填料表面，水則置換甲醇，為上樣創(chuàng)造適宜環(huán)境。

平衡：使用水或低pH緩沖液平衡柱床。此pH范圍應(yīng)低于三級胺基的pKa，確保功能團以離子態(tài)（-NR?H?）存在，具備陰離子交換能力。

上樣：樣品溶液應(yīng)調(diào)節(jié)至pH < 4，使目標(biāo)物保持陰離子狀態(tài)，同時確保功能團充分質(zhì)子化。流速控制在1 mL/min以內(nèi)，以保證充分結(jié)合。對于復(fù)雜基質(zhì)，可在上樣前進行必要的稀釋或提取處理。

淋洗：通常進行兩步淋洗：

·         第一步：使用酸性水溶液（如2%甲酸水溶液）淋洗，去除水溶性干擾物，同時維持目標(biāo)物的離子態(tài)保留

·         第二步：使用甲醇淋洗，去除疏水性雜質(zhì)（如脂類、色素）。值得注意的是，由于WAX柱對強酸性化合物的保留能力較強，可使用有機溶劑淋洗而不導(dǎo)致目標(biāo)物流失

洗脫：使用堿性有機溶液洗脫，通常為2%-5%氨水甲醇溶液。氨水提供的堿性環(huán)境將三級胺基去質(zhì)子化，離子交換作用消失，目標(biāo)物被釋放。對于某些應(yīng)用，可采用分次洗脫以提高回收率。

濃縮與復(fù)溶：洗脫液在40-50℃氮氣下吹干，用流動相復(fù)溶后進樣分析。對于熱敏感化合物（如某些著色劑），溫度需控制在50℃以下。

3.2 方法開發(fā)的關(guān)鍵參數(shù)

pH的選擇策略：WAX方法開發(fā)的核心在于上樣pH和洗脫pH的精確控制。上樣pH應(yīng)低于目標(biāo)物的pKa（通常pH < 4），確保目標(biāo)物以離子態(tài)存在，同時也低于胺基的pKa以確保功能團質(zhì)子化。洗脫則需升至pH > 8（典型為氨水體系），確保離子交換作用徹底關(guān)閉。

淋洗條件的優(yōu)化：WAX柱對強酸性化合物的強保留能力，允許采用比MAX更靈活的淋洗條件。可依次使用酸性水溶液和甲醇淋洗，最大限度地去除中性及堿性干擾物。生態(tài)環(huán)境部標(biāo)準(zhǔn)方法中，WAX柱凈化PFOA/PFOS時采用乙酸鹽緩沖液淋洗后再用甲醇淋洗的優(yōu)化方案。

洗脫體積與方式：洗脫液通常采用2%-5%氨水甲醇溶液，體積為6 mL。部分方法采用分兩次加入的方式（每次3 mL），可獲得更高的洗脫效率。

4 主流應(yīng)用領(lǐng)域與方法驗證

4.1 食品安全：合成著色劑的測定

合成著色劑是WAX柱最成熟、最廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域之一。2024年3月起實施的國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.35-2023 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》，明確將前處理方法由傳統(tǒng)的聚酰胺粉變更為WAX混合型弱陰離子交換反相吸附或等效固相萃取柱-3。這一變更標(biāo)志著WAX柱在食品色素分析領(lǐng)域已獲得官方認(rèn)可。

方法概述：以肉制品中11種合成著色劑（檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、靛藍(lán)、亮藍(lán)、喹啉黃）的測定為例，樣品經(jīng)乙醇氨水溶液提取后，通過WAX柱（150 mg/6 mL）凈化。

操作流程：

1.       活化：6 mL甲醇、6 mL水依次活化

2.       上樣：待凈化液以2-3秒/滴的流速通過柱床

3.       淋洗：6 mL 2%甲酸水溶液、6 mL甲醇依次淋洗

4.       洗脫：6 mL 2%氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液

5.       濃縮：50℃氮氣濃縮至近干，乙酸銨溶液復(fù)溶后HPLC測定

方法學(xué)驗證：加標(biāo)回收率范圍為62.2%-95.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.5%-3.9%，準(zhǔn)確性和精密度均滿足GB 5009.35-2023要求。另一項獨立驗證研究顯示，11種著色劑的回收率在71.96%-98.94%之間，RSD值在0.39%-6.15%之間。

4.2 環(huán)境監(jiān)測：全氟化合物（PFAS）的分析

全氟烷基物質(zhì)（PFAS）是一類具有環(huán)境持久性的有機污染物，其代表性化合物全氟辛酸（PFOA）和全氟辛磺酸（PFOS）被斯德哥爾摩公約列入持久性有機污染物清單。WAX柱以其對強酸性化合物的卓越保留能力，成為PFAS分析的推薦凈化柱。

方法驗證：生態(tài)環(huán)境部標(biāo)準(zhǔn)編制過程中，對HLB、WAX、PEP、C18四種固相萃取柱進行了系統(tǒng)比較。結(jié)果顯示，WAX柱對PFOA和PFOS的回收率分別為99%和100%，提取內(nèi)標(biāo)回收率分別為98%和94%，均滿足質(zhì)控要求。更重要的是，WAX柱基于弱陰離子交換機理，在洗脫過程中可增加甲醇洗凈化步驟，雜質(zhì)去除效果優(yōu)于HLB柱。

基質(zhì)適用性：針對海洋沉積物等高鹽基質(zhì)的研究表明，WAX柱同樣適用。海洋沉積物基質(zhì)加標(biāo)測試中，PFOA和PFOS的加標(biāo)回收率分別為72.5%-75.2%和94.7%-96.0%，提取內(nèi)標(biāo)回收率滿足質(zhì)控要求。

應(yīng)用擴展：WAX柱還被用于檢測土壤和水體中的強酸性污染物，如全氟酸等。Gilson公司也明確將“從生物體液中萃取強酸性藥物和代謝物（pKa < 3）"列為ASPEC X-WAX柱的應(yīng)用方向。

4.3 其他典型應(yīng)用

WAX柱的應(yīng)用范圍還在不斷擴展。在生物分析領(lǐng)域，WAX柱用于強酸性藥物的藥代動力學(xué)研究；在新藥開發(fā)中，WAX柱用于候選化合物的純化與富集。賽默飛世爾科技特別指出，WAX柱可用于濃縮磺酸鹽等強陰離子，強酸均在低pH條件下保存并通過提高pH值和中和固定相來洗脫。

表：WAX固相萃取柱典型應(yīng)用方法匯總

5 WAX的技術(shù)定位：與MAX的對比與互補

5.1 保留機制的差異

WAX與MAX同屬陰離子交換固相萃取柱，但二者的作用強度存在本質(zhì)差異：

·         MAX：以季銨基團（-N?(CH?)?）為功能團，為強堿性陰離子交換劑，在任何pH條件下均完全解離帶正電。對陰離子型化合物的保留能力極強，洗脫通常需要高離子強度或極端條件。

·         WAX：以三級胺基（-NR?）為功能團，為弱堿性陰離子交換劑，僅當(dāng)pH < pKa時帶正電。對陰離子型化合物的保留能力適中，洗脫采用堿性條件即可。

這一差異在實際應(yīng)用中表現(xiàn)為：對于含有磺酸基的強酸性化合物（pKa < 1），MAX的保留可能過強，導(dǎo)致洗脫困難；而WAX的保留強度恰到好處，洗脫更高效。相反，對于弱酸性化合物（pKa 2-8），MAX更具優(yōu)勢。

5.2 洗脫條件的對比

洗脫條件的差異是WAX與MAX最顯著的操作區(qū)別：

5.3 選擇策略：何時選用WAX？

基于上述對比，以下場景更推薦使用WAX柱：

1.       目標(biāo)物為強酸性化合物（pKa < 1）：如磺酸基化合物、全氟化合物等，WAX提供適中的保留與高效的洗脫

2.       需要高選擇性凈化：WAX柱在酸性條件下上樣、堿性條件下洗脫的“開關(guān)"特性，可有效去除中性、堿性干擾物

3.       環(huán)境水樣中的PFAS分析：WAX柱已被生態(tài)環(huán)境部標(biāo)準(zhǔn)方法驗證并推薦

4.       合成著色劑的檢測：GB 5009.35-2023已將WAX柱列為標(biāo)準(zhǔn)前處理方法

6 技術(shù)局限與發(fā)展趨勢

6.1 當(dāng)前面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)

WAX柱在實際應(yīng)用中仍存在若干局限。首先，對目標(biāo)物的pKa范圍有嚴(yán)格要求，不適用于中性或堿性化合物。其次，某些復(fù)雜基質(zhì)（如高蛋白、高脂肪樣品）中的基質(zhì)效應(yīng)可能影響定量準(zhǔn)確性，需要結(jié)合更充分的樣品前處理策略。此外，不同廠商WAX產(chǎn)品的離子交換容量和粒徑分布存在差異，可能影響方法的批次間重現(xiàn)性。

6.2 WAX技術(shù)的演進方向

自動化與在線SPE：WAX柱因其溫和的洗脫條件，特別適合與自動化固相萃取系統(tǒng)聯(lián)用。Thermo Scientific Dionex SolEx WAX柱專門設(shè)計與AutoTrace 280固相萃取系統(tǒng)配合使用，Gilson ASPEC X-WAX柱則為全自動固相萃取系統(tǒng)優(yōu)化設(shè)計。隨著自動化前處理設(shè)備的普及，WAX柱的應(yīng)用將更加標(biāo)準(zhǔn)化和高效化。

高通量檢測方法：在食品安全領(lǐng)域，WAX柱正朝著同時檢測更多種類目標(biāo)物的方向發(fā)展。GB 5009.35-2023已將著色劑檢測范圍擴展至11種，未來有望進一步增加。

新型吸附劑設(shè)計：研究人員正探索將納米材料、功能化聚合物等與WAX基體結(jié)合，進一步提升選擇性和富集效率。

7 結(jié)語

WAX固相萃取柱以其三級胺基功能團為核心，實現(xiàn)了對強酸性化合物的選擇性保留與高效洗脫。與強陰離子交換柱MAX相比，WAX在磺酸基化合物、全氟化合物、合成著色劑等強酸性目標(biāo)物的分析中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。聚合物基質(zhì)的寬pH耐受范圍和“水可浸潤"特性進一步提升了操作的穩(wěn)健性。

從食品中合成著色劑的日常監(jiān)測，到環(huán)境中全氟污染物的痕量分析，WAX柱正在為分析化學(xué)家提供可靠的解決方案。隨著自動化前處理技術(shù)的普及和新國標(biāo)的實施，WAX固相萃取柱的應(yīng)用前景將更加廣闊。在強酸性化合物分析的技術(shù)版圖上，WAX以其“精準(zhǔn)而溫和"的技術(shù)特性，占據(jù)著不可替代的重要位置。