一、標準概述

葛根，為豆科葛屬植物野葛（Pueraria lobata）或粉葛（Pueraria thomsonii）的干燥根，是我國傳統的藥食同源植物。葛根中富含多種黃酮類活性成分，其中以葛根素最為著名，此外還有大豆苷、大豆苷元、染料木素等多種黃酮類化合物。這些黃酮類成分具有抗氧化、降血糖、改善心腦血管功能等多種生物活性，是葛根品質評價的核心指標。

NY/T 4307-2023《葛根中黃酮類化合物的測定 高效液相色譜-串聯質譜法》 是由中華人民共和國農業農村部發布的一項農業行業推薦性標準。該標準于2023年2月17日發布，2023年6月1日正式實施。標準按照GB/T 1.1—2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。

該標準由農業農村部農產品質量安全監管司提出，由農業農村部農產品營養標準專家委員會歸口。起草單位為北京工業大學、浙江省農業科學院、廣西壯族自治區農業科學院。主要起草人包括張芳、齊沛沛、王穎、王雨婷、智美麗、裴鷺羽、李宜珊、嚴華兵、尚小紅等。標準總頁數為10頁。

該標準的中國標準分類號為B 04，國際標準分類號為65.120（飼料）。標準英文名稱為“Determination of flavonoids in the root of kudzu vine—High performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)"。

二、方法原理

NY/T 4307-2023所采用的核心技術是高效液相色譜-串聯質譜法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, HPLC-MS/MS）。

其基本原理可概括為以下步驟：

第一步：提取——葛根樣品中的黃酮類化合物用乙醇水溶液進行超聲提取。超聲提取利用超聲波的空化效應加速溶劑滲透和溶質擴散，實現目標化合物的快速高效提取。

第二步：凈化與過濾——提取液經離心分離后，取上清液用0.22 μm有機相濾膜過濾，去除顆粒物雜質，保護色譜柱和質譜儀免受污染。

第三步：色譜分離——凈化后的樣品溶液注入高效液相色譜系統，以C18反相色譜柱進行分離。采用梯度洗脫方式，以甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相，11種黃酮類化合物在9分鐘內實現良好分離。

第四步：質譜檢測——分離后的各化合物依次進入串聯質譜儀。采用電噴霧電離（Electrospray Ionization, ESI）技術將液相流出物中的待測物離子化，再以多反應監測（Multiple Reaction Monitoring, MRM）模式采集數據。MRM模式通過選擇特定母離子→子離子對進行監測，大幅提升了檢測的選擇性和靈敏度，是痕量定量分析的首選模式。

第五步：定量——采用外標法定量，通過比較樣品中各化合物峰的保留時間和質譜離子對信息與標準品的一致性進行定性，通過峰面積進行定量。

這一方法的核心優勢在于高效液相色譜與串聯質譜的聯用：液相色譜提供了優異的分離能力，串聯質譜則提供了極高的靈敏度和選擇性，兩者結合使該方法能夠在復雜葛根基質中同時準確定量11種黃酮類化合物。

三、試劑與材料

標準對實驗用試劑和材料有嚴格規定。

用水要求：實驗用水應符合GB/T 6682規定的一級水。一級水是最高純度的實驗用水，電阻率通常不低于18.2 MΩ·cm，可有效避免水中雜質離子和有機物對痕量分析的干擾。

試劑規格：除非另有規定，所用試劑均為分析純。其中，甲醇和甲酸應為色譜純。

主要試劑：

溶液配制：

·         10%甲醇溶液：取10 mL甲醇，加水定容至100 mL

·         30%乙醇溶液：取30 mL乙醇，加水定容至100 mL

標準品：11種黃酮類化合物標準品（葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黃素、異甘草素和鷹嘴豆芽素A），純度均不低于98%。

標準溶液配制：

·         標準儲備液：準確稱取11種待測物質的標準品，用甲醇溶解后，加入10%甲醇溶液定量稀釋，制成高濃度單標準品儲備液

·         混合標準工作液：根據檢測需要，將各標準儲備液混合稀釋成系列濃度的混合標準溶液

四、儀器與設備

標準要求配備以下核心設備：

關鍵色譜條件：

·         色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）或性能相當者

·         柱溫：40℃

·         流速：0.3 mL/min

·         進樣量：2 μL

·         流動相：甲醇和0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫

關鍵質譜條件：

·         電離方式：電噴霧電離（ESI），正負離子切換模式

·         離子化電壓：正離子模式3.5 kV，負離子模式2.5 kV

·         毛細管溫度：350℃

·         霧化氣和輔助氣：氮氣

·         碰撞氣：氬氣（純度99.99%）

·         采集模式：多反應監測（MRM）

五、分析步驟

1. 試樣制備

新鮮葛根需清洗、去皮、切片后，于60℃烘干至恒重，然后粉碎至40~60目，混勻備用。

2. 樣品前處理

前處理是保證檢測結果準確性的關鍵環節，具體流程如下：

·         稱樣：準確稱取葛根粉末0.5 g（精確至0.001 g），置于50 mL離心管中

·         提取：加入10 mL 50%乙醇溶液，室溫下超聲提取20分鐘

·         離心：以4 000 r/min離心5分鐘

·         轉移：將上清液轉移至25 mL容量瓶中

·         洗滌：沉淀用10 mL 50%乙醇溶液洗滌兩次，合并上清液至同一容量瓶

·         定容：用50%乙醇溶液定容至25 mL

·         過濾：上樣前用0.22 μm有機相濾膜過濾

3. 色譜-質譜分析

將過濾后的樣品溶液注入高效液相色譜-串聯質譜儀，在優化的色譜和質譜條件下進行分離和檢測。11種黃酮類化合物在9分鐘內實現分離。

4. 標準曲線繪制

將11種黃酮類化合物的混合標準溶液逐級稀釋成一系列濃度的標準工作液，分別進樣測定，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線相關系數應不低于0.995。

5. 定性定量方法

定性：樣品色譜峰的保留時間與標準品一致（變化不超過±2.5%），且質譜離子對的相對豐度偏差符合規定要求（相對豐度>50%時偏差±20%，20%~50%時±25%，10%~20%時±30%，≤10%時±50%）。

定量：采用外標法，根據樣品峰面積從標準曲線上查得相應濃度。若超出線性范圍，需稀釋后重新測定。單點校準濃度差不超過30%。

6. 結果計算

結果按公式計算，平行測定取算術平均值，保留三位有效數字。

六、方法學驗證

根據標準及相關資料，該方法具有良好的分析性能。

檢出限與定量限：

精密度要求：

·         重復性：在重復性條件下，兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%

·         再現性：在再現性條件下，兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的30%

七、方法優勢與應用價值

NY/T 4307-2023所規定的高效液相色譜-串聯質譜法具有以下顯著優勢：

1. 高通量、高效率：該方法可在一次進樣、9分鐘內同時完成11種黃酮類化合物的定性和定量分析。相比傳統方法逐一測定不同成分，大幅提升了檢測效率。

2. 高靈敏度：串聯質譜的MRM模式具有極高的檢測靈敏度，各化合物的檢出限低至0.03~0.1 mg/kg，能夠滿足葛根中微量黃酮類成分的準確測定需求。

3. 高選擇性：液相色譜-串聯質譜聯用技術結合了色譜的分離能力和質譜的質量分辨能力，即使在葛根這樣復雜的天然產物基質中，也能準確識別和定量目標化合物。

4. 覆蓋面廣：標準覆蓋了葛根中葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黃素、異甘草素和鷹嘴豆芽素A等11種主要黃酮類化合物，全面反映了葛根的品質特征。

5. 填補標準空白：該標準是我國葛根中多種黃酮類化合物同步測定的專項方法標準，為葛根的質量控制、資源開發和產品評價提供了統一的技術依據。

6. 適用范圍明確：標準適用于野葛和粉葛兩種主要基原，覆蓋了我國葛根藥材和食品原料的主要來源。

八、注意事項

在實際應用中，檢測人員需特別注意以下幾點：

1. 標準品的保存：標準品需避光保存，母液應于-20℃下保存。混合標準溶液應現用現配，避免因反復凍融或長時間存放導致降解。

2. 樣品前處理的把控：烘干溫度應控制在60℃，避免溫度過高導致黃酮類化合物降解。提取過程應在室溫下進行，避免加熱引起的成分變化。

3. 用水和試劑質量：必須使用GB/T 6682規定的一級水；甲醇和甲酸應為色譜純。試劑中的雜質可能影響色譜分離效果和質譜檢測的靈敏度。

4. 色譜柱的平衡與維護：色譜柱使用前需充分平衡，梯度洗脫結束后需后運行平衡。C18色譜柱對流動相條件和樣品潔凈度敏感，應確保樣品過濾充分，延長柱壽命。

5. 質譜參數的優化：質譜參數（如離子化電壓、毛細管溫度、碰撞能量等）需根據實際儀器的狀態進行適當優化。不同品牌和型號的儀器可能存在差異，檢測人員應建立適合自身儀器的最優參數。

6. 干擾峰的排除：當出現干擾峰時，可通過改變梯度洗脫程序或選擇特征離子對的方式加以排除。

7. 標準品的來源與純度：標準未指定特定標準品來源，但要求純度不低于98%。檢測人員應選擇有證標準物質或經嚴格標定的標準品。

九、總結

NY/T 4307-2023《葛根中黃酮類化合物的測定 高效液相色譜-串聯質譜法》以高效液相色譜-串聯質譜法為核心技術，為葛根中11種主要黃酮類化合物的同步測定提供了一套科學、規范、高靈敏度、高選擇性的分析方法。該標準由農業農村部發布，匯聚了北京工業大學、浙江省農業科學院、廣西壯族自治區農業科學院等單位的科研力量，具有較高的權威性和技術先進性。

葛根作為重要的藥食同源植物，其黃酮類成分的含量是評價品質的核心指標。該標準的發布和實施，有效統一了葛根中黃酮類化合物的檢測方法，填補了我國葛根品質評價領域的方法空白，為葛根的質量控制、產品開發和國際貿易提供了有力的技術支撐。

對于葛根種植企業、加工企業、檢測機構和食品安全監管部門而言，深入理解和正確應用這一標準，不僅是滿足合規要求的必要前提，更是提升葛根產品質量、促進產業高質量發展的的重要手段。隨著消費者對天然產物功能成分關注度的不斷提高，該標準在葛根產業的品質評價和標準化發展中必將發揮越來越重要的作用。檢測人員應嚴格按照標準規定的操作步驟和儀器條件開展檢測工作，確保檢測結果的準確性和可靠性。